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IVF實驗室重要常規工作的注意細節
Attending the details of crucial routines in IVF Lab
演講 Cecilia Sjöblom, Ph.D.
Queen Medical Center, Nottingham University, UK
編譯 李可弘、吳孟興
成大醫院婦產部
如何使懷孕率變得更好？好的懷孕率是一個傑出的團隊努力表現出來的結果。一個優良團隊包括醫師、護理人員及胚胎學家(embryologist)，而胚胎學家扮演的角色是在了解所有的設備和器具以及如何操作和管理這些設備及器具。
一、在實驗室中最重要的要素包括以下幾項
1. 培養箱 (incubator)
培養箱是實驗室設備中最重要的一項設備，應該是品質最高而且昂貴的，要具備有封閉的溫度系統、完整的消毒程序及多扇的門開關。必須使用維持pH值的CO2為醫療純度等級4.8 (即99.998%)的純淨氣體，而且要每日調控溫度、濕度及CO2以維持正常的pH值在7.3~7.4。利用每週兩次相關培養基(culture media)的pH值平衡測量情形來確認正確的CO2流量，並確保pH值在7.3~7.4之間(7.35±0.05)。而pH值的測量可使用pH值測量器(pH meter)，其準確度要至0.05，同時pH值在不同的溫度如25℃和37℃量出的讀數是不同的，所以要注意其是否有溫度代償(temperature compensation)的功能。另外測量器要做三點校正(three-point calibration)，即分別在pH值4、7、10三點時做校正確定。
2. 空氣 (air)
任何在培養箱外的病患物質都會受到實驗室空氣的影響。可以利用高效能微粒空氣濾器(HEPA, high efficiency particulate air filter)來處理空氣中的小微粒(low particle count)，及利用碳濾器(carbon filters)來處理微小的易揮發有機物(low VOC, volatile organic compound)，另一方面要監控制全實驗室的壓力及使用昂貴的室溫控制，最好將室溫維持在21± 2℃。
3. 加熱裝置 (heated stage)
加熱器最好採用電子式的。每週測量兩次培養液(culture medium) droplet的溫度以確認溫度情況。同時要適當地實施溫度計之校準，我們希望保存培養基在37±0.2℃ (36.8~37.2℃)，準確度為0.2℃，所以溫度計每年應由專門的實驗室做校準一次。
4. 培養液 (culture medium) 和器具 (utensils)：培養技術和胚胎培養的角色
早期胚胎(Day 0 ~ Day 3)的能量來源主要是lactate及pyruvate，後期(Day 4 ~ Day 5)則主要是glucose。在取卵過程中使用的培養液為含有HEPES或MOPS來做為緩衝劑，另外也需要carbonate及heparin。同時還需要藉由設計良好的手術室才能對取卵過程做迅速處理。
精子(Sperm)的準備：精子是配子之一，所以精子的準備就如同卵子的處理一樣重要。準備精子的培養液含有glucose以提供游動之能量，還含有抗生素streptomycin或gentamicin，且至少要將精子置於精子準備培養液(sperm preparation medium)內20分鐘，最後才在fertilization 的培養液(fertilization medium)做洗滌，整個準備工作的時間最好是在上午以利後續其他作業的進行。
受精(fertilization)要考慮使用何種培養液，可以使用自行泡製的或是已製備的成品，抑或是混合型的培養液。做卵細胞質內精子注入術(ICSI)時溫度控制是很重要的，要維持droplet有37℃，同時過程要迅速，一般在5~6分鐘內完成，最好在幾分鐘內就能完成10個ICSI的步驟。如果成功受精，在精子打入後五小時應可見2PN。
分裂期胚胎(cleavage stage embryo)：將胚胎從fertilization 培養液移到cleavage stage 培養液，因為後者含有lactate、pyruvate、EDTA及amino acid，但不含glucose。
囊胚培養(blastocyst culture)：在Day 3時將胚胎移至新的培養液，即囊胚期培養液, 其含有glucose、vitamins、amino acid，但不含EDTA。EDTA會阻斷glycolysis，對囊胚期的發育是不利的。因此在轉換培養液基前應適當地洗滌胚胎以去除之前的EDTA，不同培養液的成份可能迫使要將其放置在不同的培養箱內以方便檢查及處理。
Day 2或Day 3的胚胎植入(ET)：即是在無EDTA的培養液基下操作。多餘的胚胎可予以冷凍保存。
Day 5的ET：在Day 5做ET，某些病患可增加成功率又可減少需要冷凍保存的胚胎數。有些人認為hyaluronic acid有助於胚胎著床而嚐試使用昂貴的Embryo Glue。
培養皿(Dishes)的製備：培養皿製備的時機非常重要而且需要時常加以監控。培養液不應該保存在培養箱內，同時應在一小時內製備完所有的culture dishes，並要注意無菌操作的技術。一般取卵的培養皿在前一日下午或同日上午製備，ICSI dishes及ICSI之culture dishes在同日上午製備。而IVF後cleavage stage embryos之培養皿在前一日下午或一早時立刻製備。
仔細地善用本身的資源，這與成本息息相關。要檢討品質控管(quality control)的方法，並要求取得認證。平時要多以數據做紀錄，在採用新物品前都能先測試，證實其效果後才予以使用。
對於培養液要如何確保能有好的效果呢？除了適當地測試外，首先要注意使用藥物的等級及其成份是否適用於胚胎。同時很重要的便是要注意氨基酸(amino acid)的耐儲時間，一般培養基的amino acid約六週就會毀壞。而一般商業上的培養基成品也因為amino acid的綠故，其耐儲時間約為六個月。另外也要注意選用正確的抗生素於培養液中，通常用penicillin類即足夠。
法律上的責任及風險： 使用Sigma公司(包括oil、hyaluronidase及chemicals for freezing solutions)或Gibco公司(包括media、EBSS沖洗液)的產品於IVF上是不合法的。其產品之前都有胚胎毒性的事件發生，因此基於法律上之責任及風險，不應該使用上述的產品。
二、胚胎學家(embryologist)的角色
1. 良好的訓練培養：最好具備大學程度(university degree)、技術師(technician)、生物學家(biologist)及臨床醫師(clinician)等條件，並鼓勵其研究和參與全國或國際性之研討會。
2. 具備執行實驗室所有程序的能力：要考量是不是每個人都能完成每個計畫？是不是都具有可再現性(reproducibility)？即能保證病患不論是否在平常工作日皆能得到相同的治療，且是不是都有工作人員在實驗室。所以每個人都要對實驗室的每件事熟悉，並且信任所有的embryologists，使大家都能全力以赴。
3. 敏捷迅速是好的：對胚胎而言，在培養箱外的時間或是打開培養箱的門都是不小的stress，所以動作一定要迅速。在統計上有四項參數被證實可做為成效的指標，分別是取卵的數目、植入胚胎的數目、blastomere的勻稱性(regularity)及fragmentation的情形。而各項指標都需要高度的技術和迅速敏捷的動作配合來達成。舉例而言，當我們使用microprobe測試在油滴下50μL droplet之pH值，發現當暴露在培養箱之外的時間愈長，pH值改變的情況愈大，而置回培養箱後，恢後正常pH值所需的時間也愈久。敏捷迅速者可在三分鐘內完成一般的操程序，若暴露達十分鐘則影響pH值改變頗大。另外在老鼠的培養胚胎實驗中也發現當胚胎在培養箱外暴露愈久，pH值改變愈大，發生細胞凋亡(apoptosis)的情形也愈嚴重。因此動作一定要迅速而確實。甚至實驗室或手術室如何設計及配置都會影響到工作的速度，這是非常需要注意的。
4. 追蹤病患的結果。
三、要如何變得更好？答案便是品質控管 (品管)
品管的目的可以建立及確保品質、建構單位的基本組織及避免錯誤的發生，甚至發生時可找出原因並採取行動，然後確立改善作業的模式。當然最大的益處就是品質的保證(quality assurance)，即保證從一開始所有正確的事情總是用正確的方式來執行
四、結論
胚胎學家在改善成果上扮演決定性的角色，許多實驗室都需要好好檢討作業的方式及做局部細節的修正以利胚胎的發育。同時培養基的處理程序與培養基本身的品質是一樣重要的。擁有國際性的認證對品質控管而言是很好的工具。因此若我們想要變得更好，要能夠有效控管我們的設備使能正確地操作使用，同時改善空氣的品質，加強人員的教育訓練，並對我們的培養技術抱持樂觀信任的態度。總而言之，即在最理想的模式下使用最理想的物品。而好的懷孕率是一個傑出團隊，包括醫師、護理人員及胚胎學家努力的結果。
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